• 免疫组化技术及常见问题分析
  • 点击数:  发表日期:2013-3-29
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    免疫组化技术及常见问题分析
    免疫组织化学 (IHC) 是确定组织切片上是否存在蛋白及其位置的一种方法。尽管这种方法在定量分析时灵敏度较免疫印迹法或 ELISA 等免疫测定方法低,但它能了解整个组织的情况。适用于癌症等疾病发展及治疗情况的评估。因此,从 IHC 获得的信息结合显微技术提供了一副“宏图”,使来自其它方法的数据有据可依。
    免疫组织化学染色是抗体识别目标抗原的过程。抗体具有高度特异性,只与组织切片上相应的蛋白抗原结合。应用显色检测法即能显示抗原-抗体反应,一种显色方法是酶结合抗体作为底物,在蛋白抗原位点产生色素沉着,另一种方法是荧光检测法,即将荧光染料结合到抗体上,应用荧光显微技术检测。
    IHC-P 包括固定(通常在中性甲醛溶液中固定)、石蜡包埋、组织切片及染色。下面是IHC-P 的操作步骤:
    1. 组织的固定和包埋
    2. 切割并封固切片
    3. 脱蜡至水
    4. 抗原修复
    5. 免疫组织化学染色
    6. 复染(如果需要)
    7. 脱水并用封固剂封固
    8. 显微镜下观察染色
    抗原修复
    1. 热修复:枸橼酸钠 10 mM, pH 6.0
    2. 热修复:Tris/EDTA pH 9.0
    3. 酶解:胰蛋白酶、胃蛋白酶或其它蛋白酶。
    抗原修复的最佳方法确定后,即可进行最佳抗体浓度的确定。
    一抗浓度
    对于已知的抗体浓度,我们建议试用 0.5 μg/ml 5 μg/ml 4 °C 过夜。对于未经纯化的一抗,我们建议使用下面的初始稀释度,也可以尝试 20 倍的更高的稀释度。
    1. 全抗血清:1/50
    2. 腹腔积液:1/100
    3. 组织培养上清:不稀释
    检测
    我们建议使用辣根过氧化物酶 (HRP) 法,以过氧化物/DAB 作为底物和色素原,光学显微镜下观察。荧光显微镜法有多种荧光染料标记抗
    体,具体用哪一种要根据试验需要选择。
    固定
    正确的固定是免疫组织化学法的关键。最常用的是 10% 中性甲醛溶液 (NBF)Abcam 说明书推荐 IHC-P 使用该固定剂,另有说明的除外。
    其它不常用的固定剂还有多聚甲醛 (PFA) Bouins 液(甲醛/苦味酸)等。这些固定剂的配方详见缓冲液部分,第 77 页。
    理想的固定时间取决于组织切块的大小和类型。对于大多数组织来说,通常固定时间在 18-24 小时之间较为理想。固定不足可能导致组织
    切片边缘有染色信号强,中间无信号。固定过度将会屏蔽抗原表位。虽然抗原修复有助于克服屏蔽作用,但如果固定时间太长(比如一周)
    那么抗原修复也无济于事。
    固定后,将组织块包埋于石蜡中,用切片机切成理想厚度(依据组织一般大约在 5-20 微米)的切片,然后将切片附着在玻片上。组织切
    片最好封固在正电荷吸附或 3-氨基-丙酯--乙氧基-硅烷 (APES) 包被的玻片上,室温过夜,脱水并彻底干燥。如果切片不能很好的附着
    在玻片上,可以将其与玻片共同置于 60 °C 孵育数小时。
    脱蜡
    染色前,切片必须先脱蜡至水。如果脱蜡不彻底,会使切片不易着色。
    材料及试剂
    二甲苯
    无水乙醇
    95% 乙醇
    方法
    将切片置于架子上,依据下列方法依次冲洗:
    1. 二甲苯:2 X 3 分钟
    2. 二甲苯与无水乙醇 1:1 混匀:3 分钟
    3. 无水乙醇:2 X 3 分钟
    4. 95% 乙醇:3 分钟
    5. 70 %乙醇:3 分钟
    6. 50 % 乙醇:3 分钟
    7. 冷水流洗
     
    常见问题分析
    无染色
    一抗和二抗不匹配
    使用了针对一抗的二抗(如一抗来自兔,二抗为抗兔抗体)。
    没有足够的一抗与目标蛋白结合
    使用低稀释度抗体。延长 4 °C 孵育时间(如过夜)。
    抗体的天然结构(3D 形态)受损不适用于 IHC
    用天然(非变性的)WB 法检测抗体,确保抗体没被损坏。
    不当储存、稀释或反复冻融造成一抗/二抗试剂盒失效
    做阳性对照确认一抗/二抗试剂盒的有效性。
    靶组织中没有目标蛋白
    参照抗体供应商的建议做阳性对照。
    组织中没有足够的目标蛋白
    应用信号放大操作。
    没有避光保存二抗
    避免二抗处于光照下。
    脱蜡不彻底
    延长脱蜡时间,更换二甲苯。
    固定步骤(用福尔马林或多聚甲醛固定)修饰了抗体识别表位
    抗原修复法修复抗原表位,缩短固定时间。
    蛋白位于细胞核内(核蛋白),抗体不能穿透核膜
    在封闭液和抗体稀释液中加入通透剂。
    PBS 缓冲液被细菌污染,破坏了目标蛋白的磷酸根
    在抗体 PBS 储存液中加入 0.01% 叠氮化合物,或使用新鲜无菌的 PBS
    高背景
    没有封闭非特异性结合或封闭不充分
    延长封闭孵育周期时间,并考虑改换封闭剂。Abcam 建议用 10% 正常血清封闭切片 1 小时或 1-5% BSA 封闭培养细胞 30 分钟。
    一抗浓度过高
    滴定法寻找到最佳抗体浓度,或在浓度较低抗体中延长孵育时间(最好缓慢而准确结合)
    孵育温度过高
    4 °C 孵育切片或细胞。
    二抗发生了非特异性结合(被损坏)
    不加一抗,做二抗对照。
    组织冲洗不彻底,有固定剂残留
    所有步骤都要用 PBS 充分洗涤。
    存在内源性过氧化物酶活性
    用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑 (2 mM),或抑制过氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。(详见 IHC 说明书)。
    固定步骤反应强烈(固定剂用福尔马林和多聚甲醛)导致抗体识别位点被修饰
    改变抗原修复方法,缩短与抗原修复液的孵育时间。
    信号过度放大(信号放大技术)
    缩短信号放大孵育时间,稀释信号扩大试剂盒。
    底物过量(酶检测法)
    缩短底物孵育时间。
    染料与 PBS 在细胞/组织中相互作用(酶检测法)
    Tris 缓冲液冲洗切片后,再与底物孵育。然后,Tris 缓冲液再次冲洗细胞/切片。
    通透作用破坏膜并除去膜蛋白
    去除缓冲液中的通透剂。
    非特异性染色
    一抗/二抗浓度过高
    降低抗体浓度和/或缩短孵育时间。对比不表达目标蛋白细胞的信号强度。
    存在内源性过氧化物酶活性
    用酶抑制剂如抑制碱性磷酸酶的盐酸左旋咪唑 (2 mM),或抑制过氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。(详见 IHC 说明书)。
    一抗与被染组织同源(如用鼠一抗测鼠组织),二抗与同源的所有组织结合
    应用与组织非同源的一抗。
    切片/细胞变干
    保持切片/细胞湿度,切勿变干。