• ELISA常见问题分析
  • 点击数:  发表日期:2013-3-29
  •  

    ELISA常见问题分析
    阴性对照出现阳性结果
    试剂/样品污染
    试剂和样品可能被污染,或者由于孔之间的溅洒交叉污染。使用新鲜试剂,小心操作移液器。
    夹心 ELISA – 检测抗体与包被抗体反应
    确定使用的是正确的包被抗体和检测抗体,他们之间不会互相反应。
    酶标板洗板不彻底
    用洗液充满板孔确保每孔被充分洗涤,洗板前确保所有的剩余抗体溶液被倒净。
    抗体量过多导致非特异结合
    根据推荐用量使用抗体,尽量使用较少的抗体。
    酶标板整体背景高
    结合浓度过高或反应时间过长
    检查底物的稀释,使用建议的稀释度。当酶标板显色足够进行吸光度读取时立即用终止液终止反应。
    底物溶液或终止液不是新配制
    使用新配制的底物溶液。终止液应该是清亮的(如果它变黄,这是被污染的标志,需要重新配制)。
    没有终止反应
    如果底物反应没有被终止,颜色会继续变化。
    酶标板在酶标仪读板前放置时间过长
    颜色会继续变化(尽管加了终止液,依然会以很慢的速度变化)。
    试验器皿污染
    确保试剂是新配的并且使用的是清洁的玻璃器具。
    底物孵育过程没有避光
    底物孵育应该在避光条件下进行。
    孵育温度过高
    抗体在适宜的温度下有最佳的结合活性。确保孵育在正确的温度下进行,孵育箱要设定好适宜的温度并正常工作。孵育温度可能需要一些优化。
    抗体非特异性结合
    确保进行了封闭并使用的是恰当的封闭液。我们建议使用 5-10% 与二抗同种动物来源的血清或牛血清。
    确保板孔经过预处理以防止非特异结合。使用亲和力强、纯度高的抗体,最好经过了预吸收。
    请检查针对“阴性对照出现阳性结果”的建议
    吸光度数值低
    使用的样品中没有表达靶蛋白或者靶蛋白表达的水平低
    检查靶蛋白表达系统,确保它在您的样品中被表达出来。如果靶蛋白的表达水平低,需要增加样品使用量,或者您可能需要选择一个更灵
    敏的测定方法。确保您使用的是没有超出测定方法检测范围的阳性对照。
    抗体不足
    确定使用的是建议的抗体量,为了使结果更好可能需要增加抗体的浓度。
    底物溶液不是新鲜配制或错误结合
    使用前新鲜配制底物溶液。确保储备液在有效期内并且被正确储存,使用的浓度也是正确的。确保试剂按正确的浓度使用。
    试剂不是新鲜配制或 pH 值有误
    确保试剂配制正确并在有效期内。
    孵育时间不够长
    如果建议了孵育时间,确保按推荐的时间长度孵育抗体。为了使结果更理想,孵育时间可能需要增加。
    孵育温度太低
    抗体在适宜的温度下有最佳的结合活性,确保孵育是在正确的温度下进行,孵育箱要设定好适宜的温度并正常工作。孵育温度可能需要一
    些优化。
    确保所有的试剂在使用前是室温。
    未加终止液
    加入终止液可以增加显色反应的强度,也能固定反应最终的颜色。
    吸光度数值高
    样品和/或阳性对照吸光度数值高。吸光度没有按样品在板子上的稀释度递减。
    样品或阳性对照的浓度过高,超出了试验方法检测的范围。重新设置试验方法或者在加样前通过稀释降低样品和对照的浓度,在计算最终
    浓度时应考虑到所作的稀释。
    酶标板上吸光度不规律
    孵育时酶标板叠在一起
    酶标板叠在一起使板子每个孔的温度不能平衡一致,请避免堆叠。__吸液不一致
    确保移液器使用正确并经过校准、确保枪头插得足够紧密。板子稀释时要特别仔细,注意确保每个枪头都吸入和排出正确量的液体,这对
    平行样品结果的一致性有很大影响。
    抗体稀释液/试剂未混匀
    为保证板上所有孔的浓度一致,确保所有的试剂和样品在加到板上以前都被混合均匀。
    板孔变干涸
    确保所有孵育期间酶标板始终被盖好。放置一个潮湿的水盘(保持清洁,无菌水)在孵育箱的底部。
    洗板不充分
    这将导致一些孔没有其他孔清洗的好,残留不同量的未结合的抗体,使后面的结果产生不一致。
    酶标板底部不净影响吸光度读取
    读板前小心清洁酶标板底部。
    颜色变化过慢
    酶标板未处于适宜的温度中
    确保酶标板处于室温,试剂在使用前也处于室温。
    结合能力太弱
    使用前新鲜配制底物溶液。确保储备液在有效期内并且被正确储存,使用的浓度也是正确的。确保试剂按正确的浓度使用。
    溶液污染
    例如叠氮化钠和过氧化物酶这类污染物的存在,将会影响底物的反应,避免使用含有这些防腐剂的试剂。